Polyakryyliamidigeelielektroforeesin (PAGE) tuotantoprosessi sisältää pääasiassa vaiheita, kuten geelin valmistus, elektroforeesitoiminto, värjäys ja tulosten tarkkailu.
Geelin valmistus Erotusgeelin (10 %) valmistus: Sekoita 0 ml ddH₂O, 3 ml 30 % varastogeeliä, 5 ml 5 mol/L Tris- HCl, 1 ml 10 % SDS ja 1 ml 10 % AP, lisää sitten 10 μl pohjaan ja lisää 4 μl TEMED ja sekoita hyvin. Kaada tämä seos lasilevyjen väliin, sulje yläosa vedellä ja odota 30-60 minuuttia, jotta geeli polymeroituu kokonaan.
Pinoamisgeelin (4 %) valmistus: Sekoita 4 ml ddH₂O, 33 ml 30 % varastogeeliä, 25 ml 1 mol/l Tris- HCl, 0,2 ml 10 % SDS ja 0,2 ml 10 % AP, lisää heti 2 µl TEMEDia ja sekoita hyvin. Kaada vesi erotusgeelin päälle, lisää tämä seos ja aseta kampa välittömästi lasilevyjen väliin odottaen 15-30 minuuttia, että pinottava geeli polymeroituu kokonaan.
Elektroforeesikäyttö Näytekäsittely: Sekoita näyte yhtä suureen määrään 2XSDS-latauspuskuria, kuumenna 100 asteessa 3-5 minuuttia ja sentrifugoi sitten 12 000 rpm 1 minuutin ajan ja ota supernatantti SDS-PAGE-analyysiä varten.
Lataa: Ota 10 µl indusoituja ja indusoimattomia näytteitä ja lisää ne näytepooliin ja lisää 20 µl alhaisen molekyylipainon proteiinistandardeja kontrolliksi.
Elektroforeesi: Lisää 1X elektroforeesipuskuri elektroforeesisäiliöön, kytke virtalähde, pidä pinoamisgeelin jännite 60 V:ssa ja erotusgeelin jännite 100 V:ssa. Kun bromifenolisininen saavuttaa elektroforeesisäiliön pohjan, lopeta elektroforeesi (noin 3 tuntia).
Värjäys ja tulosten tarkkailu
Värjäys: Poista geeli lasilevyltä ja värjää sitä Coomassie Brilliant Blue -värjäysliuoksella 4-6 tunnin ajan huoneenlämmössä. Värin poistaminen: Aseta värjätty geeli värinpoistoliuokseen ja poista se useita kertoja, kunnes proteiinijuova on selvästi näkyvissä. Tulosten havainnointi: Värinpoiston jälkeen geeli voidaan valokuvata ja tallentaa. Kun värinpoistovaihe on suoritettu, aseta geeli kuvankäsittelyjärjestelmän alle valokuvausta varten ja tallenna tulokset levykkeelle.